Sunday, February 17, 2008

Polymerase Chain Reaction



Eu botei um post outro dia com uma propaganda sobre um aparelho que se chama PCR, sigla para Polymerase Chain Reaction. Esse é um equipamento padrão de laboratórios que mexem com DNA (virtualmente todos os laboratórios de biologia, bioquímica e de ciências biomédicas!). Mas eu não expliquei exatamente pra que serve isso... então, especialmente para a Lalage, aí vai:

O DNA, como vocês já devem ter visto, é uma molécula bastante longa, no formato de uma escada retorcida. Endireitando a escada e cortando ela ao meio no sentido do comprimento, temos duas cadeias bastante longas e complementares (A com T; C com G... lembram-se das aulas de biologia?). Cada uma dessas cadeias é um polímero de nucleotídeos e a seqüência desses nucleotídeos é a tal seqüência genética, onde as informações hereditárias (ou quase todas) estão armazenadas. Tudo isso no papel parece ser bonitinho e tranqüilo.

O problema é que quando se está estudando um gene, um pedaço de DNA, um trecho de um cromossomo ou um plasmídio em laboratório, é importante conseguir reproduzí-lo. As razões são diversas. Enfiar um gene em uma célula para tentar descobrir o que um gene faz. Destroçar um gene para descobrir qual é a seqüencia de nucleotídeos. "Amplificar" uma amostra porque a purificação gerou uma quantidade pequena demais. Enfim. É preciso conseguir clonar DNA.

A primeira idéia utilizada para fazer isso foi buscar usar o maquinário que a natureza já possui e que é utilizado em células regularmente. Você enfia o seu pedaço de gene numa bactéria que reproduz o gene pra você. Tem alguns passos extras que é preciso fazer, mas o problema desse processo é que, além de ser um pouco limitado, demora.

Aí, um belo dia, um bioquímico e surfista que trabalhava para uma empresa de biotecnologia na Califórnia, Kary Mullis desenvolveu um método para clonar o DNA mais rápido, e ganhou um prêmio Nobel com isso. Utilizando "primers", trechos de DNA bem curtos que indicam qual pedaço do DNA deve ser reproduzido e a DNA polimerase, enzima que faz cópias de DNA a partir do primer, é possível clonar o DNA exponencialmente.

Para o sistema funcionar bem, é preciso utilizar a DNA polimerase de bactérias que vivem em alta temperatura. Isso é útil porque a altas temperaturas, o DNA, que normalmente encontra-se naquela forma clássica de escada retorcida, se abre naturalmente e fica exposta à enzima. O método tradicional utilizado por nossas células, por exemplo, precisa de outras enzimas, as helicases, que fazem o trabalho sujo de separar as duas tiras do DNA. Além disso, o fato de a polimerase só funcionar a altas temperaturas permite um controle maior do processo, que se dá em ciclos de temperatura. Esquenta até separar tudo, esfria para que os "primers" grudem no DNA, esquenta um pouco para as DNA polimerases copiem o DNA, esquenta um pouco mais para separar tudo de novo e reiniciar o ciclo.

Este método de clonagem de DNA foi revolucionário e permitiu o uso atual do DNA para tudo: teste de paternidade, identificação de criminosos a partir de um cabelo... além, é claro, dos laboratórios de pesquisa. Agora talvez valha a pena rever a propaganda do outro dia. "PCR, when you want to know who's your daddy!"

2 comments:

  1. Deu pra ter uma idéia...
    É uma espécie de método industrial pra um trabalho de formiguinha, não?
    Mas porque é necessário destroçar um gene pra descobrir a seqüência original?

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  2. Exato, é uma mecanização de um processo.

    Agora a necessidade de destruir uma cadeia de DNA para descobrir a seqüência... Isso é preciso porque os métodos não destrutivos de identificação de moléculas não funcionam. Ao contrário das proteínas, a seqüência genética não altera a forma, então usar espectroscopia com raio-X ou ressonância magnética não ajuda. Além disso, as propriedades químicas/físicas da molécula também não se alteram, então não tem como usar algum tipo de fracionamento, ou reagente que identifique as bases... O que geralmente se faz então é destruir pedaços (demarcados quimicamente) e sequenciar com base nisso.

    Se bem que se eu me lembro bem, o método mais eficiente para se sequenciar é fazer uma clonagem, mas adicionar ao conjunto de nucleotídeos, um análogo a um deles (ddNTP) que não permite a continuação. Por exemplo, você adiciona ddATP, análogo da Adenina endógena e faz um PCR. Aí você vai ter um monte de clones parciais, todos eles terminados em Adenina. Isso te permite saber onde se encontra a Adenina, pelo tamanho das cadeias.

    Mas mesmo nesse caso, ninguém sequencia um cromossomo inteiro; é necessário quebrar um cromossomo (ou um gene muito grande) em muitas partes e combinar depois.

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